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这里用到了两项技术FIB-SEM和3D-SR，原理上分开理解一下。FIB-SEM的全称叫Cyro-Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy，我们知道SEM是利用聚焦电子束扫描样品的表面来产生样品表面的图像，不同的是，这里在电子束的基础上添加了一个聚焦离子束，它的作用是对样品进行表面刻蚀，每次刻蚀完SEM就立马对新的表面进行扫描成像，这样无缝的衔接就实现了一个三维的SEM成像效果 (装置如图)。

FIB-SEM原理 图片来源于Briggman and Bock, Curr. Op. in Neurobiol. 2012

与它类似的另外一项技术叫3D EM by diamond knife serial array，目的是类似的，都想通过这种切片的方法来实现3D的扫描成像，不同之处在于后者不用离子束而是用刀，可以看这张图，这样一层一层削没办法做到离子束刻蚀那样可控，效果上自然会差一些。

3D EM by diamond knife serial array

我猜有人会说，为什么不用冷冻电镜呢？作者这里也提到了，冷冻电镜虽然可以提供亚纳米级得三维分辨率，但一般来说只能拿它来分析一些亚微米厚度的细胞切片或者提取出来的一些生物大分子。所以想对整个细胞成像，冷冻电镜并不是最佳选择。

那么问题来了，EM分辨率上自然好过LM，但是大家都看过SEM效果，一般来说就是一张灰度图，虽然后续可以添上伪彩之类的。所以缺点是特异性比较差，没办法识别到准确结构或者蛋白的分布。因此为了实现特异性的结构可视化，且要具备较高的分辨率，作者这里选择与超分辨成像技术进行联用。之前的研究中，在涉及到光学显微镜与电子显微镜联用，特别是需要化学固定时，一般会在LM荧光保留度，EM染色致密度以及结构完整性之间进行权衡。所以这里作者也是花了心思，希望能避免这种妥协。 惊喜的是，他们发现如果不采用化学固定（例如常用的4%的多聚甲醛），而通过高压冷冻固定的方法，可以得到更好的亚结构保存度，而且在进行荧光超分辨成像时可以提供更佳的成像对比度（低温下噪声被很好地抑制了）。同时也能避免化学固定对后续电镜成像的影响，同时因为这套系统中电镜和光学成像是分开采集的，样品也无需同时进行荧光和EM染色，protocol也是完全独立的。

这是整个系统的实现流程以及原理图。

系统原理图

细胞通过正常方法培养在盖玻片上，通过高压冷冻固定并转移至低温荧光显微镜进行超分辨荧光成像。这里采用了两种超分辨成像技术，SIM和SMLM（原理这里略过了，网上应该很容易搜到），SIM的优点是成像速度快，但是分辨率不及SMLM。光学成像完成后，需要对样品EM染色，并将其嵌入到树脂中用来实现后续的FIB-SEM成像。最后一步是需要将LM和EM的成像结果align到一起，实现一张全细胞的多模式成像。给大家看一下大概的成像效果，左边是FIB-SEM成像，右边是冷冻SMLM，分别标记的是COS-7细胞的内质网（绿色）和线粒体（品红色）。

FIB-SEM与Cryo-SMLM联用

原理差不多是这样，接下来就具体介绍了这项技术在观察亚细胞结构方面得天独厚的优势。例如用FIB-SEM可以看到各种形貌和尺寸的囊泡分散在细胞各处，但是他们有可能是过氧化物酶体、溶酶体、核内体等各种形式的囊泡，这时候借助于荧光标记，就可以区分出具体某一种囊泡。他们还发现尺寸小于0.01立方米的过氧化物酶体通常呈近球形，这可能是表面张力会驱使其呈现出更小的表面积。但随着体积增大，它们会更倾向于呈现出片状，碗状或者中空结构。作者猜测这也可能是为了调节过氧化物酶体内的反应动力学速率。当然还有一些不规则结构的过氧化氢酶体，它们一般会跟跟其他细胞器靠得很近，这些组装可能可以促进不同的细胞器之间的货物转移，如过氧化物酶体和线粒体之间脂肪酸的连续分解。

不同尺寸过氧化物酶体呈现出不一样的形貌

除此之外，这套系统还可以用来观察染色质结构域及其在神经元分化过程中的重组，这部分感兴趣的大家可以看下文章。

总结部分，作者对这套系统提出了改进设想，希望能在冷冻之前进行活细胞成像，这样可以观察到更多的动态细节，同时可以促进其在药理学、光遗传学等方面的应用。但目前还没办法做到实时成像到快速冷冻之间的完美过渡。即使是这样，目前这套设备已经足够用于解决多种生物学问题。