透射电镜样品染色方法介绍

2024-03-12
铄思百检测

透射电子显微镜的主要功能是可以将物体放大至数万倍乃至千万倍，样本的细微差别经放大后往往会对结果产生极大地影响，可以说是差之毫厘，谬以千里。因此漂亮的电镜图片的获取与样本的收集、储存和染色的每一个环节都息息相关，今天铄思百检测小编，主要对染色进行介绍。

首先我们来看两张图


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图1和图2都是透射电镜下的外泌体。但是为什么看起来不太一样呢？这是由于使用不同的染色方法导致的。目前我们常用的染色主要分为正染色和负染色。图1是正染色，而图2是负染色。两种染色方法的比较如下表：

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一、正染色

1）生物组织，细胞及细菌

由于生物样本主要由碳、氢、氧、氮等轻元素组成，这些元素原子对电子的散射能力很弱，相互之间的差别也很小。尤其生物超薄切片被树脂所包埋，这些包埋树脂对电子的散射能力与样本本身差别很小。因此透射电镜生物样本超薄切片观察时像的反差极弱。为了提高图像的反差，要对超薄切片进行电子染色。这里所谓的电子染色不同于光学显微镜的染色，它是利用重金属盐(如铅盐、铀盐等)与细胞的某些成分或结构结合，由于重金属对电子散射能力很强，可以使那些与其结合的结构或成分对电子散射能力增强，从而达到提高样本本身反差的作用。目前最常用的染色液是醋酸双氧铀染色液和柠檬酸铅染色液。醋酸双氧铀能增强细胞核内物质和结缔组织的电子衬度；柠檬酸铅可以提高细胞膜结构，核糖体，糖原等结构的电子反差。


01、染液的配置

  • 醋酸双氧铀染液：常用的铀染色液为2%~5%饱和醋酸铀，用50%~70%乙醇或丙酮配制，也可以用双蒸水配制。

  • 柠檬酸铅染液配制方法如下：

    双蒸水          30ml

   硝酸铅          1.33g

   柠檬酸钠       1.76g


将以上溶液盛于50ml容量瓶中，剧烈间断地摇动30min后，加入1mol/L氢氧化钠8ml，此时乳白色的浑浊液立即变为无色透明溶液，用双蒸水加至50ml，过滤后备用。该染液的pH为12，可保存数月。


02、染色操作方法

准备两个培养皿，在底部放一块牙科用蜡板（或用熔化的石蜡做一层蜡板）。


醋酸双氧铀染色

①在蜡板上以等间距离滴上醋酸双氧铀染液液滴；
②将带有切片的铜网切片面向下漂浮在染液的液滴上，避光染色30min；
③用镊子取出染色的铜网，用新鲜的双蒸水充分清洗铜网；
④再用小滤纸吸去铜网上的水；
⑤放入铺有滤纸的培养皿中，防尘自然干燥。


柠檬酸铅染色

①在另一个放有蜡板的培养皿中，也以等间距滴上铅染液的液滴（一定在此皿中放适量的固体氢氧化钠，让其吸收空气中的CO2）；
②将染了铀的铜网切片面向下放入染液的液滴上，染色5~10min；
③用镊子夹出铜网，双蒸水充分清洗铜网；
④再用小滤纸吸去网上的水分；放入专用的切片盒内，自然干燥后即可观察。


注意事项

  • 醋酸双氧铀染色液有微量放射性，配好的染色液应存放在棕色瓶中4℃保存，用过的废液必须收集起来，集中处理。

  • 柠檬酸铅染液中的铅有毒性，铅容易与CO2反应生成沉淀而污染切片，所以铅染液需现用现配，使用的双蒸水也要新制备的。

  • 铅染的过程不能对着铜网呼气；染色时间不能过长；染色结束水洗动作要快；一定要在染色的培养皿中加固体氢氧化钠。


03、相关例图

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2）生物囊泡


01、染液的配置


  • 2%甲基纤维素：将196ml蒸馏水加热至90℃，边搅拌边加入4g甲基纤维素，置于冰浴中，搅拌冷却，直至溶液达到10℃；继续在4℃缓慢搅拌过夜，4℃静置3天；然后用蒸馏水将最终体积调至200ml；100000g，4℃离心95min；收集上清液，即为2%甲基纤维素染液。

  • 醋酸双氧铀（pH4）：称取2g醋酸双氧铀溶于50ml蒸馏水中。（染液置于20mL塑料注射器中，4℃避光保存，可保存4个月。使用前，用0.22μm过滤器过滤铀酰溶液所需的量）。

  • 草酸铀酰（pH7）：将4%醋酸双氧铀（pH4）与0.15M草酸溶液（0.945g溶于50mL蒸馏水中）以1：1的比例混合。通过滴加25%NH4OH将pH调节至7.0，以防止形成不溶性沉淀物。于4℃避光储存可保持1个月。


02、染色操作方法


取铜网置于一片封口膜上，用移液枪吸取制备好的悬浮液样本，滴于带有支持膜的铜网上。要求液滴完全覆盖住铜网。20min后用滤纸从液滴边缘吸去多余液体。PBS清洗后将铜网置于1%戊二醛中5min，蒸馏水清洗8次，每次2min。然后滴上草酸铀酰染液，染色5min，用滤纸吸去染液，再滴上2%甲基纤维素染液，冰浴10min，用滤纸吸去染液，干燥后于电子显微镜下观察。

03、相关例图


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二、负染色


负染色是利用高密度的重金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把微小的生物标本包围起来，在黑暗的背景上，样本的微细结构呈现阴性反差。所以负染色所显示的电镜图像，正好与超薄切片正染色相反，其样本结构为透明浅色，而背底则为无结构的灰色或黑色。负染色样本不需经过固定、脱水、包埋和超薄切片等操作，而是直接对沉降的样本匀浆悬浮液进行染色。操作简便，溶液使用量少，省时快速，分辨力高。


负染色技术可用于细菌、病毒、蛋白等大分子结构及生物囊泡等研究工作。特别是在病毒性致病因子的超微病理诊断中，广泛应用。


01、染液的配置


常用的有磷钨酸、磷钨酸钾、磷钨酸钠、醋酸铀等。


  • 磷钨酸或磷钨酸盐的配制：可用蒸馏水或磷酸缓冲液配制成0.5% ~ 3%的溶液，染色前应用1mol/L的氢氧化钠或氢氧化钾将pH调到6.4 ~ 7.0。

  • 醋酸铀染液的配制：将醋酸铀与蒸馏水配制成0.2% ~ 0.5%水溶液，pH为4.5 ~ 5.5。染液需现用现配。



02、染色操作方法


将制备好的悬浮液样本，用移液枪吸取，滴于铜网上。放置2min后，用滤纸从液滴边缘吸去多余液体。然后滴上负染液，染色时间2~3min，用滤纸吸去染液，干燥后电子显微镜下观察。也可将样本悬浮液或负染液滴在干燥的载玻片上，再把铜网漂浮放在悬浮液或负染液的液滴上，放置2~3min后然后用滤纸吸去铜网上的多余液体，自然干燥后即可观察。


  • 样本的纯度和浓度：如果样本含有较多杂质，会对负染效果产生影响，必要时，样本需适当纯化。样本的浓度要合适，可做不同的稀释梯度做对比观察。

  • 样本的均匀分散性：在进行负染色时，为了提高样本的均匀分散性，可在样本中加入牛血清白蛋白、杆菌肽等，例如0.5ml样本加入0.05%牛血清白蛋白3~4滴。

  • 掌握好染色时机：当铜网上的样本悬液将要干燥而尚未完全干燥时进行染色，效果比较好5。

  • 控制好样本悬液及染色液的pH：一般应使悬浮液呈中性或略偏酸性为宜(pH 6.7 ~ 7.2)。染液要在染色前用1mol/L的氢氧化钠或氢氧化钾将pH调到6.4 ~ 7.05




03、相关例图



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