扫描电镜中常规的样品制备流程

2021-08-21
铄思百检测

铄思百检测可提供扫描电镜测试,制样服务。扫描电镜已经成为各个领域研究观察各种材料的微细结构和形貌的重要手段,要得到满意的观察结果,除了要熟练掌握仪器操作技术外,还必须了解样品的性质特点,科学地掌握样品的制备技术。样品常规的制备方法包括了以下几个步骤:取样、清洗、固定、脱水、干燥、粘样以及样品的导电处理。

一、取样

取样是采集研究对象的工作,由于应用扫电镜研究材料的种类繁多,对取样很难作一般的叙述和统一的要求。一个总的原则是取样工作取决于研究目的。何时取、何处取、取何部位、取多少,完全取决于研究目的。主要考虑以下两个方面的问题:

(1)注意研究目的对样品具有针对性,避免盲目取样

(2)注意研究目的的典型性,即所取样品应该要有研究的具体对象

二、清洗

扫描电镜主要观察的是试样的表面结构,若样品表面附着粉尘、粘液、蜡质、油脂等污染物,就会影响研究结果的真实性。因此对研究样品必须进行清洗,清洗时要根据研究目的和样品性质以及污染物的性质选用不同的清洗液和清洗方法。

1)清洗液

常用清洗液有蒸馏水、生理盐水、各种缓冲液等。特殊清洗液有蛋白分解酶、氯仿、二甲苯、加酶缓冲液等。

2)清洗方法

样品具有抗变形性强的结构,且污染物是附在其表面上或者易溶下水的物质可以用蒸馏水换洗、冲洗、流洗或漂洗等;样品具有抗变形弱的结构,只能用磷酸缓冲液反复清洗,以求尽量显现其表面微;表面有蜡质的材料,要用氯仿、二甲苯脱蜡处理再清洗;对于表面难清洗的粘液、盐肪和蛋白质类物质的杂质,可用加酶缓冲液,石油醚类或不同的蛋白酶处理,使粘液成为能溶于水的物质,再反复水洗。但是,蛋白分解酶对样品表面微细结构易造成损伤,因此在处理时必须根据样品的性质掌握好处理时间和处理浓度;动物脏器表面含有较多粘液,通常把组织块放在生理盐水多次冲洗,并随时在解剖镜下检查是否干净,如果不干净可用注射器吸溶液多次冲洗,或用酶选择性消化清洗,或用显微解剖法除去。昆虫表面是硬壳的结构,用细毛笔在生理盐水中轻轻刷洗数次,就可以洗去表面附着物;有些细小的样品,可利用其比重不同,采用离心机离心清洗,如细菌、指环虫等有的污染物需要用酸成碱腐蚀溶解,然后再用蒸馏水反复清洗。

三、样品固定

1)固定的目的与要求

固定就是指采用化学或物理手段,快速而准确地(不失真)把研究样品的结构(包括内部结构)或表面形貌依原样(如生活时的状态)保存下来。固定的关键就在于“快速”和“准确”。快速是指在研究的组织结构尚未解体和未自溶之前就迅速将其固定下来。准确是指把所要研究的结构完好的依原样保存下来。

固定的目的是要尽可能地保存样品的各种成分和形态结构,使研究对象接近活体的状态。因此,取好的新鲜样品要尽快置人固定液中。对固定的要求是能使样品承受高能电子束的轰击而不变形。

2)固定剂的选择

由于任何一种固定剂都有其局限性,因此应根据实验材料和目的选择合适的固定剂。在扫描电镜生物样品备中,常用的固定剂有俄酸、醛类和高锰酸钾等。

3)固定液配

制戊二醛固定液的常用浓度为1%~4%,要配置于中性盐的“缓冲液”之中,不能用醋酸-巴比妥盐缓冲液,因为固定液和原生质液之间如果存在渗透压的差异有可能引起细胞器的破裂,加人中性盐可以增加固定液的浓度,使固定液和组织液保持等渗;而且固定与原生质接触处会发生化学反应,释放出氢离子或羟基离子,从而改变组织内的pH值,加人中性盐以吸收这些离子面维持其pH不变,避免由于pH值的变动而导致许多复化,固定液一定要具有接近样品生活时织和细胞中的pH值及渗透压,以求到样品的真实形态和结构,或者说将样品处理过程中难以避免的变形减轻到最低程度。

4)固定方法

扫描电镜制样的固定方法很多,如单固定(戊二酸单固定、锇酸熏蒸固定)、戊二酸锇酸双固定、戊二酸锇酸微波固定、戊二酸微波固定和甲醛固定等。常用戊二醛-锇酸双固定法,它适用于各种材料的固定。对一些较容易固定或不容易变形的材料,从降低实验成本考虑,可用戊二醛单固定;观察固体培养基上的真菌菌丝之类的样品时,可用锇酸熏蒸固定;对于含水量较多的样品,常用低温冷冻固定;此外还有戊二醛微波、皮二醛酸微波FAA、甲醛等固定法。但有些样品(如干种子、花粉、孢子等)即使不固定,其形态结构也不会发生变化,所以可以不固定。

固定是样品制备中重要的环节之一,除了注意固定剂、固定方法的选择,以及配置固定液的缓冲液、pH值、离子浓度和渗透压等的选择因素外,还要注意固定温度、固定时间、清洗以及固定液浸没样品。

四、脱水

脱水的目的是用脱水剂取代样品中的游离水,以便进行干燥处理。

1)脱水剂

常用脱水剂有乙醇、丙酮、叔丁醇、乙腈、六甲基二硅酸胺脘、正丁醇等。脱水剂的选择应根据干燥方法而定。如果采用临界点干燥,自然干燥、烘干干燥,冷冻干燥、微波干氮气干燥等干燥方法,均用酒精或内酮脱水;如采用真空干燥法,就用叔丁醇,乙睛、正丁醇或六甲基二硅酸胺脘脱水。

2)脱水的原理

用一种低表面张力的有机溶剂(乙醇,叔丁醇等)代换组织细胞中的游离水,使样品在十燥时表面张力减少。

3)脱水的要求

在不引起结构的变形的前提下,脱水彻底。

4)脱水方法

采用系列浓度脱水,起始浓度视样品性质不同而定,一般从30 %或50 %开始,有些材料(如甘线虫等)从10%开始脱水。为了免样品损伤,应采用样品不移出容器开始,通过弃、加脱水的力法进行换液。若样品较小,在弃脱水剂时容易丢失样品,可用擦镜纸将样品小心包好。此环节在脱水70 %时进行,注意避免人为损伤。

五、干燥

对于含水分的样品,由于水分蒸发,样品就会收缩变形(体积变化,结构皱缩或于裂),表面的微细结构就会被破坏,而且水蒸气污染物镜、光阑等重要零部件,并使荧光屏蒙上一层雾,看不见视野。因此样品在观察前,必须进行干燥处理。

六、粘样

粘样的目的是保证样品在样品台上不移动、不掉落,尤其是作倾斜、旋转观察时不掉落。此外,用导电胶粘样,能增加样品与样品台之间的导电性,使样品上聚集的二次电子能通过导电胶传输到样品台上,而不发生电荷积累。粘贴样品的材料的选择取决于所观测的样品,比如,粘贴动植物组织块样品最好使用导电胶,常用的有银粉、石粉等导电胶;需要镀金观察的样品通常用双面胶粘样;果壳、种子等较大的样品可以采用普通胶水粘样,注意待胶水自然干燥后方可装样。粘贴样品必须注意观察面向上,并且尽可能在水平面的同一高度上,操作时要注意防尘防潮和防止易飞散样品的相互混杂。

七、样品的导电处理

为了使研究试样能在扫描电镜的真空中稳定地观察表面形貌(有时是内部),并保证图像质量,对非导体的材料在观察前必须进行导电处理。导电处理的方法很多,常用的方法有金属镀膜法(真空蒸发法和离子溅射法)、导电染色法、电镀法、阳极氧化法等。在扫描电镜制样技术中用得最多的是金属镀膜法和导电染色法,这两种方法适应性广,对各类材料(包括生物样品、非金属、半导体和绝缘体等)均可采用。

金属镀膜具有如下效果:

1)样品镀膜后易产生大量二次电子,使图像反差,亮度、分辨率和清晰度都得到改善,从而提高图像质量;

2)镀膜防止了来自组织内部的信息混入到有用的信号中,保证收集到的信号是样品表面的信号,从而使图像更真实;

3)金属膜的机械强度和抗电子轰击能力都比生物样品强,所以镀膜能防止或减轻电子束对样品的损伤;

4)金属材料的电阻率比生物材料低,样品与样品台的镀膜是相连的,这有和次电子的释放,从而防止或减轻样品的放电现象。

非导体试样表面喷镀一层导电膜,这层导电膜必须符合如下要求:

1)厚度要尽可能均匀;

2)膜本身没有结构或者是微细到难以查出的程度;

3)膜要薄,不会掩盖样品表面原来的微细结构;

4)这层膜二次电子的发生率要多;

5)膜本身不能因为扫描电子束的入射而发生变化,在大气中保存样品不变质,在化学上要稳定。

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来源:铄思百检测