扫描电子显微镜（SEM）对测试样品的基本要求是干燥且导电性好。然而，微生物、细菌样品含水量高，导电性差，且容易变形。因此，对细菌微生物样品进行SEM测试之前需要对其进行相应的前处理。

注：本文提供的方法对其他生物样品同样适用。

细菌的SEM制样步骤如下：

细菌样品前处理

取液体或固体培养基中培养20h左右、旺盛生长的菌体。

(1)收集菌体:①液体培养基中的菌体，可取培养液8000rpm离心3~5min，弃上清，倒入2。5%戊二醛固定液;②固体培养基上的菌体，可在菌落表面滴几滴戊二醛固定液,轻刮菌落（注意不要刮下培养基)。将菌液吸入小离心管，离心后换入新鲜戊二醛固定。

(2) 固定：将沉淀用2.5%的戊二醛固定4 h（或4 ℃过夜），然后用0.2 M PBS缓冲液（PH=6.8）清洗3次，每次15-20min。

固定时间问题：如果时间允许则4℃过夜，测试比较着急的情况下4 h也可以。

固定和清洗问题：因为是沉淀，这里面有一个问题是需不需要把菌分散开来固定和清洗。可以分散开，然后再离心沉淀进行下一步处理，但是比较麻烦。也可以不分散开，亲自实验证明可行，对最终成像也没有发现太大区别。

沉淀分散问题：在固定和清洗过程中如果沉淀自然分散开，可以通过再离心的方式沉淀。下同。

锇酸问题：有些文献还使用了1%的锇酸固定，但是锇酸剧毒且不好买，大多数实验室都没有。少了这步处理亲自实验验证可行。

(3) 脱水：用30%、50%、70%、85%和95%的乙醇各处理一次，每次15-20min；再用100%乙醇处理两次，每次15-20min。

(4) 置换：用乙酸异戊脂置换3 h以上，最好过夜。使用乙酸异戊脂的目的是使菌更饱满，避免菌出现变形或者皱缩。

置换时间：有些文献置换时间为15 min，时间太短，容易造成菌的变形和皱缩。必须置换3 h以上。

(5) 观察：将样品依次经过二氧化碳临界点干燥和离子溅射仪喷金后，用扫描电子显微镜观察、拍照。

二氧化碳临界点干燥问题：有些文献使用了空气自然干燥，或者冷冻干燥，但是如果实验条件允许，建议使用二氧化碳临界点干燥。

喷金相关问题：喷金的目的是使样品导电。微生物样品导电性差，建议延长喷金时间。在一般样品喷金60 s的基础上适当增加10-20 s。喷金时间也不是越长越好，因为随着喷金时间的增长，金膜的厚度越大，对于样品的微观细节影响也越大。因此，需要在导电性和减少对样品结构的破坏之间平衡。

喷铂问题：铂颗粒比金小，因此对样品微观结构的破坏比金小，但导电性比金差，也比金贵。对于微生物几微米的尺寸来说，喷金就可以。

细菌样品特殊制备方法;

1，固体培养基中的菌体

用镊子夹一小块盖玻片，轻轻放在旺盛生长的菌体上，粘附一定的细菌.然后用双面胶将此盖玻片贴在棕色瓶瓶盖内壁，在棕色瓶内加入适量1%饿酸，盖上含有样品的瓶盖,熏蒸固定2h 以上。然后用双面胶将盖玻片粘在样品台上，喷金,进行扫描电镜观察。

2，液体培养基中的菌体

取一定的培养液，8000rpm离心3~5min,弃上清液﹐加入2.5%戊二醛固定 2h,pH 7。2磷酸盐缓冲液清洗，然后加入蒸馏水稀释，充分混合后用滴管取混合液一滴于小块盖玻片上，吸附2min，用滤纸吸去多余溶液。然后用双面胶将此盖玻片贴在棕色瓶瓶盖内壁,在棕色瓶内加入适量1%饿酸,盖上含有样品的瓶盖,熏蒸固定2h 以上。然后用双面胶将盖玻片粘在样品台上，喷金，进行扫描电镜观察。

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