纤维素、半纤维素、木质素（范氏洗涤法）三素检测

（一）仪器和试剂

1、仪器

ANKOM220纤维分析仪；封口机；干燥器；电子天平；马弗炉（中心实验室仪器）；烘箱；热水器；玻璃棒。

2、试剂、耗材

乙二胺四乙酸二钠、四硼酸钠、十二烷基硫酸钠、三甘油、无水磷酸二氢钠、无水亚硫酸钠、丙酮、十六烷三甲基溴化胺、浓硫酸；

F57专用滤袋、专用记号笔、烧杯、纸。

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（二）实验操作

1、中性洗涤纤维（Neutraldetergent fibre，NDF）测定

（1）试剂准备

中性洗涤液：称取18.610 g乙二胺四乙酸二钠和6.810 g四硼酸钠同时放入1000 mL烧杯中，加少量水加热溶解后，再加入30.000 g十二烷基硫酸钠和10.0 mL三甘油。称取4.560 g无水磷酸二氢钠，置于另一烧杯中，加少量水，微微加热溶解后倾入第一个烧杯中，用蒸馏水稀释至1000 mL。

耐高温α淀粉酶：17400 U·mL^-1的活性

（2）测定步骤

装袋：称取滤袋质量m₁（称重精确到0.1 mg）。称取约0.5g（精确到0.1 mg）风干样品（样品需粉碎通过1 mm筛孔），记为M，装入滤袋（避免样品沾到滤袋边缘）。同时称取空白滤袋质量C₁。距滤袋边缘4 mm处封口（空白滤袋内不装样品封口，其处理步骤同其它样品）。

脱脂：将盛有样品并封口的滤袋至于500 mL的广口瓶中，加入丙酮没过样品，摇动10次，浸提10min，弃去丙酮，用新鲜丙酮重复此操作至脱脂完全（重复2－3次）。将盛有样品的滤袋风干（约5 min），然后均匀地铺展滤袋中的样品，放到样品架上。

消煮：将样品架（每次消煮最多24个样）放入ANKOM220纤维分析仪的消煮罐中，确保每个托盘放3个，加入1900-2000mL中性洗涤液，如果一批消煮的样品数量少于20个，每个样品加入100 mL中性洗涤剂（为保证洗涤液完全浸没滤袋，至少应加入1500 mL洗涤液）。然后加入无水亚硫酸钠（0.5 g/50 mL ND）和4.0 mL 的耐高温α淀粉酶。打开电源开关，用温度控制器的“▲”“▼”键，设定蒸煮温度为100 ℃（此值一般已经设定，无需更改），用“H”“M”“S”键分别设定时、分和秒，定时75 min。按下搅拌和加热按扭，观察搅拌器，确保搅拌良好后锁紧上盖。待温度上升到设定温度时，再按“START 启动定时器，倒计时。

水洗：待定时器鸣叫后，再次按下“AGITATE”（蓝灯灭）和“HEAT”（红灯灭）键，停止搅拌和加热，慢慢打开排液阀将洗涤液排出（注意：一定要先排液后开盖）。关闭排液阀，打开上盖，加入1900～2000mL热蒸馏水（70～90℃）和4mL的耐高温α淀粉酶，锁好上盖，搅拌5 min，排液，重复3次以上。

丙酮洗：取出样品，轻轻挤压使水流出，置样品于250 mL广口瓶中，加入丙酮没过样品，浸泡3-5 min取出，轻轻挤压使丙酮流出，风干样品。

注意：放入烘箱前应确保丙酮挥发干净，以免引起火灾。

烘干称重：将风干后的样品于102±2 ℃的烘箱干燥2-4h，取出置于干燥袋中冷却后称重记为m₂，空白滤袋称重记为C₂。

（3）结果计算

NDF（%）＝[(m₂-m₁)+（C₁-C₂）]÷M×100   （公式中符号见表14）

2、酸性洗涤纤维（Aciddetergent fibre, ADF）的测定

（1）试剂

酸性洗涤剂溶液：称取20 g十六烷三甲基溴化胺（CTAB），溶于1 L已标定过的0.50mol·L^-1硫酸溶液中，加热搅拌使其溶解。

0.50 mol·L^-1硫酸溶液：取49 g（约27mL）浓硫酸，慢慢加入已装有500 mL水的烧杯中，冷却后注入1000 mL容量瓶中，加水至刻度，标定。

丙酮（分析纯）

（2）测定步骤

酸煮：将样品摆放到样品架上，放入ANKOM220纤维分析仪的消煮罐中，加入1900～2000mL的硫酸溶液，如果一批消煮的样品数量少于20个，每个样品加入100 mL中性洗涤剂（为保证洗涤液完全浸没滤袋，至少应加入1500 mL洗涤液）。设定消煮温度为100 ℃，按下搅拌和加热按钮，确保搅拌良好，锁紧上盖，待温度上升到100 ℃时，启动定时器，定时60 min。

水洗(同前)

丙酮洗（同前）

烘干称重：102±2 ℃烘干2-4 h，称重m₃，同时称取空白质量C₃。

（3）结果计算

ADF（%）＝[(m₃-m₁)+(C₁-C₃)]÷M×100%   （公式中符号见表14）

3、酸性洗涤木质素（Aciddetergent lignin, ADL）的测定

（1）试剂

72％硫酸，配制方法如下：

浓硫酸（98%）：水（体积比为）=1.4:1（配置1 L溶液：583mL浓硫酸，倒入417 mL水）。

（2）步骤

酸泡：测定ADF后，将干的滤袋放入300 mL的烧杯中，加72 ％硫酸没过样品（约250mL）。放一个200 mL的烧杯于其中，上下按动搅动样品30min，浸泡3h。

水洗（方法同前）

丙酮洗（方法同前）

烘干称重：将酸泡后的滤袋和样品在102±2 ℃条件下烘干2-4h，称重m₄，空白滤袋重记C₄。

灰化：将干燥称重后的样品至于预先恒重（105 ℃烘2小时）的坩埚中（坩埚重记为m₅），空白所用坩埚重为C₅，具体步骤如下：

①把样品放入马弗炉（不要贴近马弗炉壁），设置马弗炉温度105 ℃，当温度升到105 ℃时，计时12分钟；

②以每分钟升温10 ℃对马弗炉进行升温（每隔1分钟调节一次温度，每次温度调升10 ℃，第15次设置为250 ℃）；

③当温度达到250℃后，计时30分钟；

④以每分钟升温20 ℃对马弗炉进行升温（每隔1分钟调节一次温度，每次温度调升20 ℃，第16次设置为575 ℃）；

⑤当温度达到575℃后，计时3小时；

⑥调节马弗炉温度为105 ℃，当温度降至105℃后，关闭马弗炉，迅速把坩埚移至干燥器中冷却至温室称重m₆，装有空白样品的坩埚和灰分重记为C₆。

（3）结果计算

灰分（%）=[(m₆-m₅)-(C₆-C₅)]÷M×100

ADL（%）＝[(m₄+m₅-m₆)-(C₄+C₅-C₆)]÷M×100

公式中符号见表14。

（三）结果分析与计算

1、分析

中性洗涤液：洗掉糖、淀粉、脂肪等可溶性物质，剩余NDF（纤维素、半纤维素、木质素和灰分）

酸性洗涤液：洗掉半纤维素，剩余ADF（纤维素、木质素和灰分）

酸泡：洗掉纤维素，剩余ADL（木质素）和灰分

灰化：烧尽木质素，剩余灰分

2、按照以下公式计算纤维素、半纤维素和木质素：

半纤维素＝NDF-ADF

纤维素＝ADF-（ADL+灰分）

木质素＝ADL

方法来源